NAD蘋果酸酶(NADME)測試盒微量法

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商品屬性：

測定意義：

ME廣泛存在于微生物、培養細胞、動物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應，產生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應，是蘋果酸代謝的關鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關。近年來植物ME活性測定較多，已經成為抗氧化研究的熱點。根據輔酶專一性和對底物特異性的不同，可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
測定原理：
NAD-ME催化NAD+還原成NADH，在340nm下測定NADH增加速率。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存。；

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

樣本的前處理：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量

（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，

加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

訂購流程:

1、訂購前,請與銷售員核對產品中文名稱/CAS號/英文名稱等。

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5、我司提供完善的售后服務,使用過程中如有任何疑問,可提供技術指導。

測定步驟:

1、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、 檢測工作液的配制：用時在試劑三中加入 15mL 試劑一和 1mL 蒸餾水，充分混勻待用；

用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

3、 測定前將檢測工作液在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、55μL 試劑二和 160μL 工作液，混勻

后立即記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A2-A1。

注意：如果 ΔA＜0.005，可將反應時間延長到 2 分鐘或 5 分鐘。

NAD-ME 活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 3617×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T =3617×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T =7.234×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2.25×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：

比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：

反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

b.用 96 孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T= 7234×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T = 7234×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣÷V 樣總×500) ÷T =14.468×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2.25×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol；d：96孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：

反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量；500：細菌或細胞總數，500 萬。

生化試劑盒的使用注意事項：

選擇合適的試劑盒：根據實驗目的和檢測對象選擇合適的試劑盒，確保實驗的準確性和可靠性。

嚴格遵循說明書：按照試劑盒的說明書進行操作，避免誤用或浪費。

注意保存條件：按照試劑盒的保存條件進行妥善保存，避免陽光直射、高溫或潮濕等不利因素。

控制實驗條件：在實驗過程中嚴格控制實驗條件，如溫度、時間、pH值等，以確保實驗結果的穩定性。

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